Le applicazioni di sequenziamento del DNA nella ricerca biologica sono in crescita. Un fattore significativo di questa crescita è il sequenziamento di nuova generazione (NGS), una moderna tecnologia di sequenziamento del DNA strumentale per il raggiungimento di sequenze di DNA e genomi completi degli esseri umani, di molti animali, piante e specie microbiche.

L’NGS può offrire rapidità, affidabilità e un buon rapporto costo-efficacia. Tuttavia, questi benefici dipendono anche dalla qualità del DNA sequenziato. Scarsa qualità o inefficienza nelle prime fasi del processo di sequenziamento possono provocare costi aggiuntivi causati da errori, rilavorazioni o successivi scarti. Quando il sequenziamento del DNA determina sviluppo, test e produzione di farmaci mirati o il monitoraggio e il contenimento di virus pericolosi ed epidemie, i risultati non possono essere messi a rischio da imprudenti scorciatoie a monte.

I kit di pulizia rappresentano un cardine del processo NGS. Hanno un immediato impatto su efficienza e qualità ed effetti chiave a valle. Chiaramente, non vale la pena pregiudicare le intere operazioni di sequenziamento del DNA e molto altro solo per risparmiare qualcosa sul prezzo per campione con kit più economici ma con minori prestazioni, qualità più bassa e minore efficienza.

È quindi fondamentale esaminare un kit di pulizia per sequenziamento del DNA prima di scegliere e confrontare le sue prestazioni complessive con altri kit, all’inizio delle operazioni NGS o al momento di valutare il passaggio a una soluzione di kit di pulizia differente. Anche se il costo del kit di pulizia rappresenta sempre un fattore importante, il passaggio a prodotti differenti o più economici non è necessariamente più vantaggioso e concentrarsi esclusivamente sul prezzo può avere conseguenze altamente indesiderate.

Fattore 1 - Rendimento

Il primo e forse più evidente fattore è la percentuale di rendimento, la concentrazione finale di DNA divisa per la concentrazione iniziale, moltiplicata per 100%. Per qualità ed efficienza ottimali, la percentuale di rendimento deve essere compresa tra l’80% e il 95%. Rendimenti inferiori possono compromettere la qualità dei dati a valle. Non tutti i kit di pulizia sono in grado di raggiungere un rendimento costantemente alto (vedere la Figura 1).

Fattore 2 - Purezza

Un DNA di buona qualità deve avere un rapporto A260/A280 di almeno 1,8. Un valore inferiore indica la presenza di proteine contaminanti. Allo stesso modo, un rapporto A260/A230 inferiore a 2,0 indica la presenza di altri contaminanti.

Fattore 3 - Tempo

Il tempo è spesso la risorsa più preziosa. Tempi di pulizia inferiori offrono risultati migliori. Ogni volta che è necessaria una fase di pulizia aggiuntiva durante l’esecuzione di kit di costruzione di librerie, si aggiunge una differenza compresa tra 30 e 45 minuti per fase di pulizia (vedere la Figura 2). Ad esempio, 3 fasi di pulizia sono pari a una differenza compresa tra 1,5 e 2,25 ore. Questa differenza si moltiplica nuovamente con l’aumento dell’attività generale NGS.

Fattore 4 - Prestazioni prevedibili

L’uniformità della dimensione dei frammenti di DNA influisce sulla qualità e sull’efficienza del sequenziamento del DNA. La dimensione iniziale dei frammenti deve essere correttamente mirata per consentire una lunghezza aggiuntiva delle coppie di basi (bp) con l’aggiunta di adattatori ai frammenti per il sequenziamento. Idealmente, le concentrazioni delle dimensioni dei frammenti rimangono elevate e prevedibili con l’uso di rapporti di legame differenti (vedere il grafico di AMPure XP nella Figura 3). Questo è un fattore importante se un utente sta valutando di passare da un kit di pulizia a un altro. Le tracce seguenti mostrano differenze relative nell’altezza del picco e nel recupero (Figura 3).

Fattore 5 - Rischi del passaggio

L’esempio sopra di rapporti di legame che danno concentrazioni differenti delle dimensioni dei frammenti di DNA per kit di pulizia differenti rappresenta un rischio del passaggio a un altro kit di pulizia. Altri rischi sono:

• Tempo e lavoro extra necessari per valutare un nuovo kit di pulizia
• Obbligo di ripetere più tardi il sequenziamento se il nuovo prodotto non offre le stesse prestazioni del prodotto originale
• Un fornitore di kit di librerie ritira il suo supporto per la risoluzione dei problemi in caso di uso “fuori etichetta” con un prodotto di pulizia non raccomandato dal fornitore stesso

Conclusione

I kit economici di pulizia per il sequenziamento del DNA possono offrire prestazioni scarse e compromettere il risultato generale dell’NGS. I rischi includono perdita di tempo, efficienza non ottimale e scoperte incomplete.

In confronto, AMPure XP è mirato agli aspetti realmente importanti per aziende e organizzazioni che lavorano con il sequenziamento del DNA: uniformità e affidabilità delle prestazioni lotto dopo lotto, qualità di produzione e tempi di risposta giusti.

AMPure XP è raccomandato da 215 fornitori di kit di costruzione di librerie. Spesso i fornitori di questi kit raccomandano AMPure XP come unica opzione di pulizia. AMPure XP è stato anche citato in oltre 21.000 articoli su Google Scholar.

Utilizzando AMPure XP come kit di pulizia è possibile rispettare la tabella di marcia dei progetti di sequenziamento e continuare a fornire i migliori risultati possibili per clienti, pazienti e riviste.

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