Estrazione manuale o automatizzata di RNA, DNA o acidi nucleici totali da tessuti FFPE

L’estrazione dell’acido nucleico dal tessuto fissato in formalina e incluso in paraffina (Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded, FFPE) è difficile a causa della natura della preparazione del tessuto. Il kit reagenti FormaPure XL rappresenta un sistema a singola chimica con capacità dimostrata per l’uso nel sequenziamento di nuova generazione (Next-Generation Sequencing, NGS), nonché per altre applicazioni a valle, tra cui qPCR. Per ridurre al minimo il rischio di perdere informazioni genetiche di fondamentale importanza, è necessario ottimizzare l'integrità, la resa e la purezza di un campione FFPE.

• Dati che mostrano l’estrazione uniforme di RNA e/o DNA compatibile con NGS da un solo campione FFPE
• Sistema flessibile a singola chimica comprovato per l'uso con un input del campione di input da 10 µm a 70 µm
• Acidi nucleici con integrità superiore per una maggiore sensibilità per le applicazioni qPCR e NGS*

Le prestazioni NGS iniziano con l’integrità dell’RNA

L’analisi dei frammenti dimostra che i kit reagenti FormaPure XL estraggono l’RNA con un punteggio DV200 con percentuale più alta rispetto all’RNA estratto dallo stesso blocchetto utilizzando un kit basato su colonne. Punteggi DV200 con percentuale più alta possono determinare NGS con prestazioni migliori.

Figura 1 e Figura 2: FormaPure XL Total e FormaPure XL RNA isolano l’RNA con maggiore integrità rispetto a un kit basato su colonne. L’RNA è stato valutato con Agilent RNA ScreenTape. RNA isolato con FormaPure XL RNA (tracce blu) e un kit alternativo basato su colonne (tracce arancioni) da quattro diversi campioni FFPE. Le estrazioni da seno e intestino sono state effettuate con sette frammenti da 10 μm. Sono presentati i valori DV200 per ciascun elettroferogramma. I valori percentuali DV200 rappresentano la percentuale di frammenti di RNA maggiori di 200 nucleotidi.

Figura 3: FormaPure XL Total e FormaPure XL RNA isolano l’RNA con pari o maggiore di integrità rispetto a un kit basato su colonne e un kit di lisi basato su sonicazione, come valutato su Agilent RNA ScreenTape. Le estrazioni sono avvenuta da frammenti da 1 a 10 μm di tessuto mammario, intestinale, prostatico e polmonare. Sono rappresentati i valori DV200 percentuali medi per tre replicati tecnici e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei tre replicati tecnici.

I rendimenti di acido nucleico sono determinati dalle seguenti variabili:
Tipo di tessuto; dimensione del tessuto; tipo di tumore; metodo di fissazione; metodo di inclusione in paraffina; reagenti; conservazione del prodotto; quantità dell’input di tessuto; chimica di estrazione; età del blocchetto di tessuto.

Figura 4: L’RNA e il DNA sono stati isolati utilizzando FormaPure XL Total e un kit basato su colonne da 5 diversi tipi di campioni di tessuto FFPE. Tutte le estrazioni sono state effettuate con sette frammenti da 10 μm. Il rendimento medio di tre replicati tecnici è riportato sopra. Il rendimento di acido nucleico è stato stimato utilizzando l’analisi Quant-it (ThermoFisher Scientific).

FormaPure XL può consentire all'utente di eseguire l’estrazione dalla quantità desiderata di frammenti. Non tutti i laboratori riceveranno la stessa quantità di tessuto da cui estrarre campioni. FormaPure XL consente all’utente di estrarre la quantità di tessuto definita.

Tabella 1: L’RNA e il DNA sono stati isolati con FormaPure XL Total da tessuto mammario FFPE. È stato utilizzato un numero crescente di frammenti. Il rendimento di acido nucleico è aumentato con l’aumento del numero di frammenti, tranne per il DNA estratto da sette frammenti da 10 μm (a causa di variazioni del contenuto di tessuto all’interno dei frammenti).

Flusso di lavoro visivo

1. Deparaffinizzazione del tessuto FFPE
2. Lisi del tessuto FFPE e decrosslink dell’RNA
3. Trasferimento di metà del lisato per il flusso di lavoro dell’RNA
4. Legame dell’RNA alle biglie magnetiche
5. Separazione delle biglie magnetiche dai contaminanti
6. Lavaggio delle biglie magnetiche con etanolo all’80% per la rimozione dei contaminanti
7. Trattamento dei campioni con DNAsi I
8. Rilegame dell’RNA alle biglie magnetiche con RBA
9. Separazione delle biglie magnetiche dai contaminanti
10. Lavaggio delle biglie magnetiche con etanolo al 70% per la rimozione dei contaminanti
11. Eluizione dell’RNA dalle biglie magnetiche
12. Processazione del lisato rimanente per il flusso di lavoro del DNA
13. Decrosslink del DNA
14. Trasferimento del lisato rimanente per il flusso di lavoro del DNA
15. Trattamento dei campioni con RNAsi A
16. Legame del DNA alle biglie magnetiche
17. Separazione delle biglie magnetiche dai contaminanti
18. Lavaggio delle biglie magnetiche con etanolo all’80% per la rimozione dei contaminanti
19. Eluizione del DNA dalle biglie magnetiche
20. Trasferimento dell’RNA eluito e del DNA in una piastra di conservazione

Tempistica del metodo automatizzato e manuale

FormaPure XL Total, RNA e DNA sono un set flessibile di kit di estrazione idonei per flussi di lavoro manuali e automatizzati.

• Scalabile in base alla produttività
• Transizione rapida con metodi pronti all’implementazione
• Supporto competente per reagenti, automazione e metodi da parte di un unico fornitore

Tabella 2: Tempo di preparazione manuale stimato e tempo totale, in ore, richiesto per eseguire 8, 24, 48 e 96 estrazioni di acido nucleico con FormaPure XL Total, RNA o DNA. I metodi possono essere eseguiti manualmente o automatizzati su un sistema di manipolazione dei liquidi. I dati rappresentati in questa tabella sono basati su Biomek i7 Hybrid. È indicata la differenza di tempo tra manuale e automazione. NR=Non raccomandato.

Prodotti FormaPure XL per l’isolamento di RNA, DNA e acidi nucleici totali da tessuto FFPE

I kit reagenti FormaPure sono disponibili in più dimensioni e tipi di estrazione in base all’applicazione e alle esigenze di capacità produttiva. Contattaci oggi stesso compilando il modulo in questa pagina per un preventivo.

Beckman Coulter non offre garanzie di alcun tipo, esplicite o implicite, in merito a questo protocollo, incluse ma non limitate alle garanzie di idoneità per uno scopo particolare o alla commerciabilità o alla conformità del protocollo. Tutte le garanzie sono espressamente escluse. L’utilizzo del metodo è esclusivamente a rischio del cliente, senza ricorso a Beckman Coulter. Senza indicazione o convalida per l’uso nella diagnosi delle malattie o di altre condizioni. Questo protocollo è a solo scopo dimostrativo e non è convalidato da Beckman Coulter.

© 2019 Beckman Coulter, Inc. Tutti i diritti riservati. Beckman Coulter, il logo stilizzato e i marchi di prodotti e servizi Beckman Coulter citati nel presente documento sono marchi commerciali o marchi registrati di Beckman Coulter, Inc. negli Stati Uniti e negli altri Paesi. Tutti gli altri marchi sono di proprietà dei rispettivi proprietari.