Isolamento dell’RNA totale e purificazione dalle cellule eucariotiche coltivate

Il kit RNAdvance Cell v2 è un kit reagenti per l’isolamento dell’acido ribonucleico (RNA) basato sulla tecnologia delle biglie paramagnetiche SPRI. Consente la purificazione dell’RNA di alta qualità da linee cellulari. L’estrazione può essere eseguita manualmente nel formato di una provetta da 2 ml o nel formato da 96 pozzetti o automatizzato nel formato da 96 pozzetti su diverse workstation per la manipolazione dei liquidi Beckman Coulter Biomek. L’RNA totale estratto utilizzando il kit RNAdvance Cell v2 è privo di gDNA rilevabile e altri inibitori della PCR.

• Rimozione efficiente di DNA genomico e di altri contaminanti
• L’estrazione e la purificazione di RNA totale di alta qualità da colture cellulari supporta l'estrazione di un ampio numero di campioni per l’analisi dell'espressione genica

 

Elevato recupero di RNA da parte di RNAdvance Cell v2

L’RNA è stato estratto da cellule MRC-5 utilizzando RNAdvance Cell v2 e i kit di altri fornitori. Nella Figura 1 (di seguito) i campioni sono stati quantificati utilizzando NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Sono state recuperate quantità maggiori di RNA utilizzando il kit RNAdvance Cell v2 rispetto ai kit degli altri 3 fornitori. Nella Figura 2 (di seguito) i campioni sono stati valutati per la purezza utilizzando NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Per MRC-5, RNAdvance Cell v2 ha purificato l’RNA con rapporti A260/280 entro limiti soddisfacenti.

 

L’RNA può essere estratto da varie linee cellulari

L’RNA è stato estratto da 5 x 104 cellule MRC-5, ACHN, HCT116 e PANC1 usando RNAdvance Cell v2. I campioni sono stati quantificati e valutati per la purezza utilizzando NanoDrop (Thermo Fisher Scientific). Il rendimento di RNA dipende dalla linea cellulare, ma la qualità dell’RNA è uniforme in tutte le linee cellulari ed entro rapporti A260/280 soddisfacenti.

Tipo di cellula	Rendimento (µg)	A260/A280
MRC-5	1,8	2,02
ACHN	0,5	1,98
HCT116	0,3	2,00
PANC1	1,0	1,93

 

Isolamento di RNA di alta qualità con punteggi RIN medi pari a 9,8 da una varietà di linee cellulari

RNAdvance Cell v2 isola RNA di alta qualità. L’RNA totale estratto da cellule MRC-5, ACHN, HCT116 e PANC1 e da RNA umano universale di riferimento (Agilent) sono stati analizzati su Agilent RNA ScreenTape per valutare la qualità. Nella Figura 3 (di seguito) i valori RIN di tutti i campioni isolati con RNAdvance Cell v2 sono risultati tutti ≥ 9,4, il che indica che è stato recuperato RNA intatto e di alta qualità. Nella Figura 4 (di seguito) è mostrata una traccia campione di RNA isolato da cellule MRC-5 corrispondente alla prima corsia di gel; i picchi di rRNA 18s e 28s sono evidenti.

 

La rimozione efficiente del DNA genomico e degli inibitori della PCR consente dati e risultati di qualità nelle applicazioni qRT-PCR

La capacità per la PCR è stata valutata mediante qRT-PCR utilizzando un set di primer (forward primer 5´-ggacttcgagcaagagatgg-3´ e reverse primer 5´-agcactgtgttggcgtacag-3´) progettato per estendere gli esoni 4 e 5 del gene beta (β)-actina (ActB) per produrre 327 ampliconi di coppie di basi. Nella Figura 5 (sopra) il controllo No RT mostra la rimozione del DNA che può interferire con le applicazioni RNA a valle. Nella Figura 6 (sopra) l'RNA isolato da 4 linee cellulari con il kit RNAdvance Cell v2 è risultato amplificabile, indicando che il kit ha rimosso gli inibitori della PCR. Nella Figura 7 (a destra) l’RNA estratto da cellule ACHN utilizzando RNAdvance Cell v2 e kit di altri 3 fornitori è stato utilizzato in qRT-PCR con e senza aggiunta della trascrittasi inversa. RNAdvance Cell v2 e i kit dei fornitori A e B hanno registrato una rimozione sufficiente del DNA, ma il kit del fornitore C presentava un’amplificazione uguale con e senza trascrittasi inversa, il che indica contaminazione del DNA.

 

 

Flusso di lavoro visivo

1. Lisi delle cellule in tampone di lisi e proteinasi K
2. Legame dell’RNA alle biglie magnetiche
3. Separazione delle biglie magnetiche dai contaminanti
4. Lavaggio delle biglie magnetiche con tampone di lavaggio ed etanolo al 70% per la rimozione dei contaminanti
5. Trattamento dei campioni con DNAsi I
6. Rilegame dell’RNA alle biglie magnetiche con tampone di legame
7. Lavaggio delle biglie magnetiche con etanolo al 70% per la rimozione dei contaminanti
8. Eluizione dell’RNA dalle biglie magnetiche
9. Trasferimento nella nuova piastra per la conservazione

 

Estrazione dell’RNA da campioni in meno tempo con meno azioni di pipettamento rispetto agli utenti dei kit basati su colonne

La Figura 8 (sopra) rappresenta il tempo totale per l’estrazione dell’RNA per 1-96 campioni con RNAdvance Cell v2 e un kit basato su colonne. Con 30 campioni, il tempo totale di estrazione dell’RNA dalle cellule è inferiore con RNAdvance Cell v2. Nella Figura 9 (sopra) il numero totale di azioni di pipettamento, che includono la dispensazione in un campione, la miscelazione di un campione e lo smaltimento dei puntali, per 1, 8, 24, 48 e 96 campioni. Con la possibilità di utilizzare una pipetta multicanale, le azioni di pipettamento sono significativamente minori rispetto a quelle necessarie con kit basati su colonne.

 

Per l’uso con metodi manuali o automatizzati basati sulla dimensione del batch o sulla capacità produttiva generale

Tempo di preparazione manuale stimato e tempo totale, in ore, richiesto per eseguire 8, 24, 48 e 96 estrazioni di RNA. I metodi possono essere eseguiti manualmente o automatizzati su una workstation Biomek i7 Hybrid. È indicata la differenza di tempo tra manuale e automazione (NR = non raccomandato).

RNAdvance Cell v2			Manuale	Automatizzato
Dimens. batch	8	Tempo di preparazione manuale	0,25	0,25
		Tempo totale	1,15	2,43
	24	Tempo di preparazione manuale	0,25	0,25
		Tempo totale	1,30	2,50
	48	Tempo di preparazione manuale	NR	0,50
		Tempo totale	NR	2,86
	96	Tempo di preparazione manuale	NR	0,50
		Tempo totale	NR	3,08

 

Prodotti RNAdvance Cell v2 per l'isolamento dell’RNA dalle cellule

RNAdvance Cell v2 è disponibile in kit di due dimensioni basati sulle tue esigenze di capacità produttiva. Fare clic sul codice (PN) specifico riportato di seguito per acquistare o richiedere un preventivo. Per ulteriori informazioni, consultare la pagina Isolamento dell’RNA dalle cellule relativa a RNAdvance Cell v2.

CODICE #	NOME	PREPARAZIONI
A47942	Kit RNAdvance Cell v2	100
A47943	Kit RNAdvance Cell v2	960

 

 

Senza indicazione o convalida per l’uso nella diagnosi delle malattie o di altre condizioni.
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