Criteri di conformità del sistema AQUIOS STEM alle linee guida internazionali per la conta delle cellule progenitrici e staminali ematopoietiche CD34+ in clinica
Dr. Andreas Böhmler
L’analisi delle cellule progenitrici e staminali ematopoietiche CD34+ è uno dei test maggiormente regolamentati in citofluorimetria clinica, poiché la quantificazione di eventi rari come nel caso delle cellule staminali può rappresentare una sfida in termini di conformità e comparabilità sia all’interno di uno stesso laboratorio che tra diversi laboratori.
Questa scheda informativa di prodotto riassume i componenti essenziali e le informazioni tecniche per la conta delle CD34+ in conformità con quattro linee guida e norme comunemente utilizzate in ambito internazionale, e descrive i metodi adottati dal sistema AQUIOS STEM per l’enumerazione di CD34+ per rispettare questi requisiti, necessari per le procedure di accreditamento del laboratorio.
Per consultare le linee guida
Con il ricorso sempre più frequente alle cellule progenitrici e staminali periferiche mobilizzate (PBSC) a scopo di trapianto, Sutherland et al., di concerto con la Società internazionale per l'ematoterapia e l'ingegneria tissutale (ISHAGE), nel 1996 hanno codificato una serie di norme per la conta delle CD34+ con l’obiettivo di fornire un metodo semplice e accurato in grado di assicurare un elevato grado di precisione e riproducibilità tra diversi laboratori. Questo ha prodotto le Linee guida ISHAGE, che sono ben presto diventate lo standard di riferimento per la conta delle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ mediante citofluorimetria1.
Nel 1998, Keeney et al. hanno pubblicato una versione modificata delle linee guida del 1996, introducendo le biglie per il conteggio assoluto, aggiungendo 7-AAD come colorante per determinare la vitalità delle cellule ed escludere le cellule morte, e un reagente di lisi che non contiene alcun fissativo2. Queste modifiche hanno trasformato il protocollo di base in un metodo a piattaforma singola e le Linee guida ISHAGE per singola piattaforma con colorazione della vitalità sono rimaste per lo più intatte dopo oltre 20 anni. Molti enti governativi a livello internazionale, nazionale e regionale hanno adattato i componenti essenziali e i dettagli tecnici del protocollo ISHAGE per l’enumerazione di CD34+, ad esempio la Farmacopea europea (Ph. Eur.), il principale punto di riferimento per il controllo della qualità dei farmaci nell’Unione Europea3. Diversamente dalle Linee guida ISHAGE, le norme descritte nella Ph. Eur. sono giuridicamente vincolanti, come previsto dalla Convenzione del Consiglio d’Europa sull’elaborazione di una farmacopea europea, e dalla legislazione farmaceutica nazionale e dell’UE.
Le norme sul trapianto di cellule progenitrici ematopoietiche sono pubblicate dalla Fondazione per l’accreditamento della terapia cellulare (FACT) e da JACIE, il Comitato di accreditamento congiunto di ISCT ed EBMT, società europea per i trapianti di sangue e midollo osseo4. Inoltre, le norme NetCord-FACT definiscono le linee guida per l’uso di cellule progenitrici ematopoietiche da sangue cordonale5.
Sistema AQUIOS STEM
Il sistema AQUIOS STEM, composto dal software AQUIOS STEM per il sistema di citofluorimetria AQUIOS CL, dal kit di reagenti AQUIOS STEM, AQUIOS STEM CD34 Control Cells e and Flow-Check Fluorospheres (Tabella 1), è un dispositivo medico-diagnostico in vitro indicato per l'uso da parte di professionisti di laboratorio per l’analisi di parametri indicati nella Tabella 2, Parametri del sistema, per il sistema di citofluorimetria automatizzato AQUIOS CL.
Si tratta di un test di quantificazione utilizzato per l’identificazione e la quantificazione delle popolazioni di cellule indicate nella Tabella 2 in pazienti che si stanno preparando per il trapianto autologo o allogenico di cellule progenitrici ematopoietiche, e in donatori che partecipano a programmi di mobilizzazione o raccolta per trapianti autologhi o allogenici di cellule progenitrici ematopoietiche. Fare riferimento alla Tabella 2 per informazioni dettagliate sui tipi di campioni e anticoagulanti supportati.
Tabella 1 Componenti del sistema AQUIOS STEM. Tutti i componenti sono indicati per l’uso diagnostico in vitro in conformità con i regolamenti dei Paesi in cui i prodotti sono registrati.
| Strumentazione | Descrizione |
|---|---|
| Sistema di citofluorimetria AQUIOS CL | Sistema di citofluorimetria AQUIOS CL con gruppo di continuità |
| Software | |
| Software AQUIOS STEM | Software per la quantificazione di CD34+ con algoritmi di gating automatizzati per AQUIOS CL. Il modulo per il controllo qualità del software AQUIOS STEM permette di accedere a eIQAP, il programma di controllo qualità elettronico interlaboratorio di Beckman Coulter, che consente agli utenti di ottenere report di confronto tra gruppi di pari per i dati di controllo qualità dei propri laboratori. |
| Reagenti | |
| Kit AQUIOS STEM, 50 test | I reagenti del kit AQUIOS STEM sono costituiti da un reagente anticorpale monoclonale murino CD45-FITC/CD34-PE, un controllo negativo corrispondente (CD45-FITC/CD34-CTRL), un reagente per il conteggio assoluto (fluorosfere per il conteggio AQUIOS STEM), un reagente di vitalità cellulare (7-AAD), e un reagente di lisi pronto per l’uso (soluzione di lisi AQUIOS STEM). |
| AQUIOS STEM CD34 Control Cells, 2 livelli, 15 test ciascuno | Le cellule di controllo AQUIOS STEM CD34 sono preparazioni liquide di leucociti umani stabilizzati per la verifica dei parametri CD34 e CD45 che fanno parte del sistema AQUIOS STEM. Ciascun kit contiene 2 livelli di CD34 con circa 10 cellule CD34 per µL (livello 1) e circa 30 cellule CD34+ per µL (livello 2). |
| Flow-Check Fluorospheres, 3x10 mL | Le fluorosfere di controllo del flusso sono costituite da una sospensione testata di fluorosfere (microsfere fluorescenti) utilizzate per la verifica quotidiana dell’allineamento ottico del citofluorimetro e del sistema fluidico. |
Tabella 2 Parametri del sistema AQUIOS STEM
| Tipo di campione | Anticoagulante | Kit/Parametri | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| K2EDTA | K3EDTA | Eparina | ACD-A Mix Eparina | ACD-A | CPD | Kit AQUIOS Stem | |
| Sangue intero (WB) | X | X | X | Percentuale CD34 Conteggio assoluto CD34 Conteggio assoluto CD45 |
|||
| Sangue intero mobilizzato (MB) | X | X | X | ||||
| Midollo osseo fresco o scongelato (BM) | X | X | X | X | |||
| Prodotto di aferesi fresco o scongelato (AP) | X | X | |||||
| Sangue cordonale fresco o scongelato (CB) | X | X | |||||
Questa scheda informativa di prodotto riassume i requisiti necessari per l’enumerazione delle CD34+ specificati nei documenti sopra indicati e descrive i metodi adottati dal sistema AQUIOS STEM per rispettare questi requisiti, necessari per le procedure di accreditamento del laboratorio. Le categorie e i requisiti indicati nel presente documento non sono esaustivi, ma si soffermano in particolare sugli aspetti tecnici della procedura di enumerazione di CD34+; altri ambiti delle linee guida e delle norme che indicano i requisiti previsti per laboratori, strutture e gestione della qualità, non vengono presi in considerazione.
Norme e linee guida internazionali per l’analisi di cellule progenitrici e staminali ematopoietiche CD34+
- Linee guida ISHAGE
- Farmacopea europea (Ph. Eur.)
- FACT - JACIE Norme internazionali per la raccolta, il trattamento e la somministrazione dei prodotti per la terapia con cellule ematopoietiche
- NetCord - FACT Norme internazionali per la raccolta e la conservazione di sangue cordonale e per la distribuzione ai fini della somministrazione
Per assicurare il rispetto di tutti gli standard di cura previsti per la vostra attività, vi invitiamo a consultare il testo completo dei documenti oggetto di questa scheda informativa di prodotto, oltre alle normative e ai regolamenti locali, nazionali e internazionali applicabili nel vostro Paese.
Bibliografia
- Sutherland DR, Anderson L, Keeney M, Nayar R, Chin-Yee I: The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. J Hematother. 1996 Jun;5(3):213-26.
- Keeney M, Chin-Yee I, Weir K, Popma J, Nayar R, Sutherland DR: Single platform flow cytometric absolute CD34+ cell counts based on the ISHAGE guidelines. International Society of Hematotherapy and Graft Engineering. Cytometry. 1998 Apr 15;34(2):61-70.
- EDQM Council of Europe: European Pharmacopoeia (Ph. Eur.). 10th Edition 2019-2022. Website: https://pheur.edqm.eu/home
- Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT), Joint Accreditation Committee – ISCT and EBMT (JACIE): International standards for hematopoietic cellular therapy product collection, processing, and administration. 8th Edition, Version 8.1, 2021. Website: http://www.factwebsite.org/
- Foundation for the Accreditation of Cellular Therapy (FACT): NetCord-FACT international standards for cord blood collection, banking, and release for administration. 7th Edition, 2019. Website: http://www.factwebsite.org/
- Whitby A, Whitby L, Fletcher M, Reilly JT, Sutherland DR, Keeney M, Barnett D: ISHAGE protocol: are we doing it correctly? Cytometry B Clin Cytom. 2012 Jan;82B:9-17.
