L'estrazione di RNA da campioni virali è un passo importante per la ricerca sui patogeni. Qui presentiamo un metodo comprovato di estrazione dell’RNA da campioni virali.

Scopo

L’estrazione di acidi nucleici virali è il primo passo per l’analisi genomica a valle mediante RT-PCR. Qui presentiamo uno studio di ricerca effettuato presso il Miami Cancer Institute in collaborazione con Beckman Coulter Life Sciences, utilizzando i reagenti di ricerca RNAdvance Viral descritti nell’estrazione di acidi nucleici virali da tamponi utilizzando le istruzioni per l'uso del kit di estrazione RNAdvance Viral. Dimostriamo l’uso dell'RNA virale estratto con i reagenti RNAdvance Viral nel nostro flusso di lavoro RT-PCR. I dati presentati includono i dati di concordanza e le prestazioni analitiche dei reagenti rispetto a un kit di estrazione della concorrenza mediante il confronto dei valori Ct qRT-PCR da materiale di input su mezzo di trasporto universale.

Descrizione generale del flusso di lavoro

I reagenti RNAdvance Viral permettono l’analisi chimica per l’isolamento dell’RNA che utilizza la tecnologia di immobilizzazione reversibile di fase solida (Solid Phase Reversible Immobilization, SPRI). Consentono la generazione di RNA altamente purificato con compatibilità dimostrata con un massimo di 200 μl di campione di input. L’estrazione di 24 campioni processati manualmente richiede circa 1 ora. Per una processazione ad alta capacità produttiva, è possibile analizzare due piastre (192 campioni) in 1,75 ore utilizzando una soluzione di estrazione Biomek i5 con interazioni umane minime. Il flusso di lavoro di RNAdvance Viral (Figura 1) consiste nelle fasi di lisi del campione e legame-lavaggio-eluizione.

I dati presentati sono stati prodotti in maniera indipendente dal Miami Cancer Institute.

1. Stima delle prestazioni analitiche - Sensibilità

I controlli Exact Diagnostics SARS-CoV-2 Standard positivi (RUO, EDX, n. cat. COV019) e negativi (EDX, n. cat. COV000) sono stati arricchiti nel mezzo di trasporto universale negativo aggregato (HEALTHLINK, n. cat. 330C.DHI) a 200, 20, 2 e 0,2 copie/μl. L’RNA è stato estratto manualmente utilizzando reagenti Beckman Coulter RNAdvance Viral o un altro kit di estrazione a base di biglie (concorrente A). Le analisi qRT-PCR sono state svolte con il kit Integrated DNA Technologies (IDT) 2019-nCoV RUO.

I valori Ct sono stati valutati tramite qRT-PCR utilizzando set di primer di ricerca mirati ai frammenti N1, N2, e N3 del nucleocapside di SARS-CoV-2 (N1, N2, e N3) per il rilevamento di RNA virale e il set di primer RNasi P (RP) per il rilevamento dell’RNA RNasi P umano. I controlli positivi 2019-nCoV_N_Positive Control (IDT: 10006625) e negativi qPCR (NTC Ambion, n. cat. AM4932) sono stati inclusi per garantire il corretto controllo del test. Exact Diagnostics RNA Standard (SARS-CoV-2 Standard) senza estrazione è stato utilizzato per il controllo dell’efficienza di recupero.

I dati mostrati nel valore Ct sono paragonabili tra i reagenti RNAdvance Viral e il kit di estrazione del concorrente A (Tabella 1). L’RNA estratto con i reagenti RNAdvance Viral ha inoltre mostrato valori Ct coerenti rispetto all’RNA standard (SARS-CoV-2 Standard senza estrazione). I reagenti RNAdvance Viral hanno dimostrato un’efficienza di recupero maggiore del 95% senza inibizione della PCR. L’efficienza di recupero è stata calcolata dal valore Ct di RNAdvance Viral/Ct di RNA Standard per primer SARS-CoV-2 N1, SARS-CoV-2 N2 e SARS-CoV-2 N3 a tutte le titolazioni virali.

Le prestazione analitiche sono state determinate come la concentrazione di copie virali più bassa che mostra l’amplificazione della PCR. Per entrambe le estrazioni, 0,2 copie/μl di Exact Diagnostics RNA Standard hanno mostrato un valore CT indeterminato, che indica prestazioni analitiche comprese tra 0,2 e 2 copie/μl.

Tabella 1. Valutazione dell’efficienza dell’estrazione

2. Conferma delle prestazioni analitiche

Per confermare le prestazioni analitiche (1 copia/μl) ottenute dalla fase di stima dei reagenti RNAdvance Viral, l’RNA è stato estratto da Exact Diagnostics RNA Standard e arricchito nel mezzo di trasporto universale negativo aggregato. La concentrazione di input di RNA Standard è di 1 e 2 copie/μl. In ciascuna concentrazione di input sono stati analizzati campioni quadruplicati.

Il valore Ct è stato valutato tramite qRT-PCR utilizzando il protocollo nella sezione dell’impostazione dell’analisi descritta nelle istruzioni del pannello diagnostico RT-PCR per il nuovo Coronavirus 2019 (2019-nCoV) del CDC (CDC-006-00019). Per ogni campione sono stati testati i geni N1, N2, N3 e RP. Inoltre, i controlli RUO 2019-nCoV_N_Positive Control (IDT: 10006625) e negativi qPCR (NTC Ambion, n. cat. AM4932) sono stati inclusi per garantire la corretta procedura di test.

Sia 1 che 2 copie/μl di RNA Standard mostrano un valore Ct comparabile (Tabella 2) ed è stato confermato che 1 copia/μl indica le prestazioni analitiche dei reagenti RNAdvance Viral.

Tabella 2. Conferma delle prestazioni analitiche dei reagenti RNAdvance Viral

3. Concordanza dei campioni

La concordanza dei campioni è stata dimostrata confrontando i valori Ct su campioni di RNA precedentemente testati estratti utilizzando il kit del concorrente A. Si sono registrati 24 positivi noti con valori Ct < 40 e 23 negativi noti (Tabella 3) al SARS-CoV-2. Tutti i campioni sono stati prelevati con un tampone COPAN e conservati nel mezzo di trasporto universale HEALTHLINK prima dell’estrazione. È stato estratto manualmente l’RNA da tutti i campioni con i reagenti RNAdvance Viral. L’analisi RT-PCR è stata eseguita con set di primer/sonde N2 e RP. Il controllo 2019-nCoV_N_Positive (IDT: 10006625) e il controllo negativo qPCR (NTC Ambion, n. cat. AM4932) sono stati inclusi per garantire una corretta procedura del test.

I dati indicano una concordanza del 100% per tutti i campioni positivi. Tuttavia, 1 dei 23 campioni precedentemente risultati positivi era negativo, il che indica una concordanza del 96%. L’operatore lo ha annotato come errore di manipolazione dei campioni.

Tabella 3. Valori Ct e prestazioni comparative di campioni di SARS-CoV-2 positivi e negativi noti

Conclusione

Questa valutazione mostra una soluzione di estrazione a uso di ricerca per l'isolamento affidabile dell’RNA virale da campioni di tamponi prelevati con un mezzo di trasporto universale per la ricerca. I dati presentati mostrano che l’efficienza di estrazione di RNAdvance Viral è maggiore del 95% e non inibisce l’analisi qRT-PCR a valle. Le prestazioni analitiche arrivano a 1 copia/μl di RNA virale. La concordanza di rilevamento dimostrata con campioni positivi e negativi noti è rispettivamente del 100% e del 96%, con un’accuratezza di circa il 98% rispetto all’RNA estratto con i valori Ct di un kit concorrente. I dati di valutazione prodotti hanno consentito l’uso dei reagenti RNAdvance Viral per l'estrazione dell'RNA virale da campioni di tamponi con mezzi di trasporto universali. 

¹Qi Wei, Ph.D.; ¹Weiming Shen, MS, ASCP^CM; ¹Haixue Gan; ¹Dianelis Mondejar Alvarez; ¹Mendizabal; ¹Tania E. Pumariega; ²Cindy Heath; ²Han Wei, Ph.D.
Affiliazione: ¹Miami Cancer Institute, Miami, LF; ²Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN

Beckman Coulter non offre garanzie di alcun tipo, esplicite o implicite, in merito a questo protocollo, incluse ma non limitate alle garanzie di idoneità per uno scopo particolare o alla commerciabilità o alla conformità del protocollo. Tutte le garanzie sono espressamente escluse. L’utilizzo del metodo è esclusivamente a rischio del cliente, senza ricorso a Beckman Coulter. Senza indicazione o convalida per l’uso nella diagnosi delle malattie o di altre condizioni. Questo protocollo è a solo scopo dimostrativo e non è convalidato da Beckman Coulter.

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¹Qi Wei, Ph.D.; ¹Weiming Shen, MS, ASCP^CM; ¹Haixue Gan; ¹Dianelis Mondejar Alvarez; ¹Mendizabal; ¹Tania E. Pumariega; ²Cindy Heath; ²Han Wei, Ph.D.
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