Introduzione 

Il Microbioreattore BioLector è un dispositivo da banco per lo screening ad alta produttività delle colture microbiche in combinazione con il monitoraggio in tempo reale dei parametri di coltura più comuni come biomassa, pH, ossigeno disciolto (DO) e fluorescenza di varie molecole o proteine fluorescenti nel terreno colturale.

Figura 1. Il microbioreattore BioLector XT per colture microbiche ad alta produttività.

La grande quantità di dati generati permette uno sviluppo accurato e affidabile del processo biologico, la caratterizzazione dei ceppi, l'ottimizzazione dei terreni colturali e lo screening dei cloni nel più breve tempo possibile. Le colture ad alta produttività vengono effettuate in piastre per microtitolazione (MTP) di formato standard SBS/SLAS con 32 o 48 pozzetti di coltura ciascuna, che consentono di effettuare fino a 48 esperimenti simultanei in un'unica esecuzione del microbioreattore. La testina di gassificazione permette la gassificazione diretta della piastra per microtitolazione durante un esperimento di coltura.

In combinazione con il sistema di manipolazione dei liquidi RoboLector, il microbioreattore automatizzato RoboLector XT mette a disposizione una piattaforma di coltura automatizzata unica nel suo genere, integrando la coltura ad alta produttività e la capacità di monitoraggio in tempo reale con una manipolazione precisa e accurata dei liquidi resa possibile da un sistema robotico. Le colture automatizzate permettono di effettuare esperimenti complessi: Questa piattaforma prepara autonomamente le composizioni dei terreni colturali, per esempio a partire da modelli di progettazione degli esperimenti (DoE). In combinazione con il sistema microfluidico delle piastre per microtitolazione microfluidiche, sono disponibili varie opzioni di feeding e prelievo di campioni. Per esempio, è possibile aggiungere induttori di coltura e ulteriori soluzioni nutritive oppure regolare i valori del pH. Ogni processo viene attivato e monitorato individualmente per ogni singolo pozzetto, sia in base a un programma predefinito, sia tramite segnali di processo online. Il prelievo di campioni automatico in vari target, ad esempio una stazione di refrigerazione, facilita il monitoraggio e il controllo ottimale del processo.

In questa nota tecnica vengono descritte le possibili modalità d'uso del coperchio di gassificazione, le diverse opzioni di gassificazione e tutte le varianti del coperchio di gassificazione configurabili per le applicazioni biologiche nel microbioreattore BioLector XT e nel microbioreattore automatizzato RoboLector XT.

Applicazione delle diverse modalità di gassificazione

Prima di preparare la configurazione fisica di una coltura è necessario creare un protocollo nel software BioLection, come descritto nel manuale utente del microbioreattore BioLector XT. All'interno del software BioLection è possibile scegliere tra cinque diverse modalità di gassificazione. A seconda dell'applicazione biologica, un'opzione di gassificazione definita è essenziale per il successo degli esperimenti di coltura, ad esempio per realizzare una specifica condizione come l'ossigeno disciolto nel mezzo di coltura. Come mostrato nella figura 2, è possibile scegliere facilmente tra aria atmosferica, N2 per la modalità anaerobica e la regolazione negativa dell’O₂, CO₂ per la regolazione positiva della CO₂, oppure O₂ per la regolazione positiva dell’O₂.

Figura 2. Le impostazioni di protocollo del software BioLection permettono di scegliere tra cinque diverse modalità di gassificazione.

È inoltre possibile selezionare portate costanti o variabili comprese tra 5 e 50 ml/min, come indicato nella figura 3.

Figura 3. Tramite il software BioLection, nel menu delle impostazioni di protocollo, è possibile selezionare portate costanti o variabili comprese tra 5 e 50 ml/min.

Scelta del coperchio di gassificazione più indicato

Dopo aver configurato tutte le condizioni dell'esperimento nel software BioLection, preparare la piastra per microtitolazione come indicato di seguito:

• Iniziare la preparazione in un ambiente sterile pipettando il mezzo di coltura, il brodo di fermentazione o qualsiasi altro liquido nei pozzetti di coltura richiesti in base alla configurazione dell’esperimento.
• Aggiungere agenti di regolazione del pH o soluzioni nutritive nei pozzetti del serbatoio della piastra per microtitolazione nelle file A e B.
• Fissare la pellicola in silicone della piastra per microtitolazione con l’applicatore XT, come indicato nel manuale del microbioreattore BioLector XT.
  
   

Oltre alle opzioni di gassificazione, è possibile scegliere tra quattro varianti del coperchio di gassificazione, in base all’applicazione biologica.

1. E BD48 per esperimenti non microfluidici standard nel microbioreattore BioLector XT (figura 4).
2. E-BDR48 per esperimenti non microfluidici nello strumento RoboLector XT (figura 5).
3. E-BD32 per esperimenti microfluidici standard nel microbioreattore BioLector XT (figura 6).
4. E-BDR32 per esperimenti microfluidici nel microbioreattore RoboLector XT (figura 7).

È necessario ricordare che tutti i materiali correlati al coperchio di gassificazione sono compatibili con l’uso in presenza di ossigeno, quindi è obbligatorio indossare guanti ai fini della manipolazione di questi componenti per evitare contaminazioni.

Figura 4. Variante EBD48 del coperchio di gassificazione per colture in batch standard nel microbioreattore BioLector XT.

Figura 5. Variante E-BDR48 del coperchio di gassificazione per esperimenti non microfluidici nel microbioreattore automatizzato RoboLector XT.

Figura 6. Variante E-BD32 del coperchio di gassificazione per esperimenti microfluidici standard nel microbioreattore BioLector XT.

Figura 7. Variante E-BDR32 del coperchio di gassificazione per esperimenti microfluidici nel microbioreattore automatizzato RoboLector XT.

Una volta preparata la piastra per microtitolazione, è possibile fissarvi la testina di gassificazione.

• Collocare il coperchio di gassificazione sulla piastra per microtitolazione e verificare che gli angoli smussati della piastra e della testina si trovino sullo stesso lato, ad esempio sul lato sinistro.
• Spingere verso il basso il coperchio di gassificazione per fissarvi la piastra per microtitolazione. I due perni metallici situati sulla parte superiore della testina a sinistra e a destra fuoriescono quando sono regolati correttamente.
  
   

Nota: per gli esperimenti condotti con il microbioreattore automatizzato RoboLector XT, collocare una seconda pellicola in silicone F-RSXT sul coperchio di gassificazione. I perni assicureranno un orientamento corretto per l'applicazione (vedi figura 8). Per questo motivo, l’uso dell’applicatore non è necessario.

Figura 8. Preparazione della testina di gassificazione E-BDR32 per esperimenti microfluidici nello strumento RoboLector XT.

Agganciare la testina robotica (E-BDRL) al coperchio di gassificazione come mostrato in figura 9.

Figura 9. Variante E-BDR32 del coperchio di gassificazione per esperimenti microfluidici nel microbioreattore automatizzato RoboLector XT. Fissaggio della testina robotica al coperchio di gassificazione E-BDR32.

Collocazione del coperchio di gassificazione nella camera di incubazione del microbioreattore BioLector XT

• Rimuovere il corperchio di gassificazione dall’ambiente sterile o, se applicabile, anaerobico. Non inclinare o scuotere la piastra per microtitolazione per evitare di inumidire la pellicola della piastra dall’interno.
• Verificare che tutti i condotti di gassificazione siano fissati al coperchio di gassificazione. Se necessario, fissare tutti i condotti al coperchio di gassificazione prima di collocarlo nella camera di incubazione.
  
   

Figura 10. Fissaggio dei condotti al coperchio di gassificazione.

3. Verificare che la posizione della piastra di adattamento nella camera di incubazione del microbioreattore sia corretta nella modalità 48 (figura 11) o nella modalità 32 (figura 12).

Figura 11. Posizionamento della piastra di adattamento nella modalità 48.

Figura 12. Posizionamento della piastra di adattamento nella modalità 32.

4. Collocare il coperchio di gassificazione nella camera di incubazione, come mostrato nella figura 12, e abbassare tutte le levette per fissarla (vedere figura 14).

Figura 13. Collocare il coperchio di gassificazione nella camera di incubazione.

Figura 14. Abbassare la levetta in metallo per fissare il coperchio di gassificazione.

5. Fissare i condotti del coperchio di gassificazione ai connettori a innesto sulla tavola vibrante sul lato anteriore della camera di incubazione del microbioreattore. Adesso l’esperimento di coltura può iniziare.

Rimozione del coperchio di gassificazione dalla camera di incubazione

Una volta terminato l'esperimento di coltura, disattivare la pressione MF e interrompere l'alimentazione del gas. Quindi, tirare per scollegare i raccordi a connessione rapida dalla testina di gassificazione (figura 15) e tutte le levette in metallo per rimuovere la testina di gassificazione e la piastra per microtitolazione dalla camera di incubazione. È possibile rimuovere la piastra per microtitolazione anche premendo i perni metallici nella parte superiore della testina di gassificazione.

Figura 15. Rimozione del coperchio di gassificazione dalla camera di incubazione.

Pulizia del coperchio di gassificazione

Quando si disinfetta il coperchio di gassificazione, lasciar evaporare il prodotto disinfettante sotto una cappa sterile.

Nota: l’esposizione del coperchio di gassificazione a ossigeno puro può causare ossidazione. Non lubrificare gli assi X-Y. Non utilizzare agenti sgrassanti liquidi. Utilizzare solo panni in microfibra privi di lanugine e verificare che il detergente non sgoccioli dal tessuto.

Importante: quando si utilizza il modulo microfluidico, acidi e alcali concentrati potrebbero depositarsi nel coperchio di gassificazione.